A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro
Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*
▋摘要
背景：目前为止恰巧蔓延当今世界的新型冠状大肠杆菌得病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个发展中国家和地区大广为人知，截至 2021 年 4 同年已引发大约 1.28 亿人得病毒，大约 280 所到之处丧生。意味著，尚无可理论上降低 COVID-19 活命埋率的治疗法方法有。我们深入研究了一种传统观念的之抑制作用生素药物抑制作用生素——生发肺毒药物液 (RDS) 的潜在抑制作用冠状大肠杆菌活命开放性，该药物液主要化学物质为东方医学传统观念之中用作治疗法心脏得病因的之中泡茶。
结果：RDS 抑制作用 SARS-CoV 太快大肠杆菌、SARS-CoV-2 太快大肠杆菌、分离亚型大肠杆菌-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 假型大肠杆菌以及传染开放性 SARS-CoV-2 和共通的 Ha-CoV-2 种属大肠杆菌 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对孔洞核的得病毒。我们全面性显然 RDS 可以这样一来灭活命 SARS-CoV-2 大肠杆菌外层的传染开放性。此外，我们挖掘借助于 RDS 还可绕过亚型霍乱大肠杆菌对孔洞核的得病毒。
论断：RDS 可普遍抑制作用心脏大肠杆菌得病毒。关键词：SARS-CoV-2，COVID-19，冠状大肠杆菌，抑制作用大肠杆菌治疗法，生发肺毒药物液，传统观念之抑制作用生素，SARS-CoV，亚型霍乱，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 假型大肠杆菌
▋背景
目前为止恰巧蔓延当今世界的新型冠状大肠杆菌得病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个发展中国家和地区大广为人知，截至 2021 年 4 同年已引发大约 1.28 亿人得病毒，大约 280 所到之处丧生。意味著，尚无可理论上降低 COVID-19 活命埋率的治疗法方法有。新借助于现的 COVID-19 大肠杆菌菌株为冠状大肠杆菌 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在严重急开放性呼喉综合征就其冠状大肠杆菌各种型德式之中的兄妹大肠杆菌[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 最初都是在之东亚挖掘借助于的；SARS-CoV 大肠杆菌于 2002 年 11 同年在广东省首次被挖掘借助于[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 同年在武汉首次被挖掘借助于[1,7,8]。在之东亚，这两次由冠状大肠杆菌引起的传染得病之中，之抑制作用生素以外被普遍采用，主要用途紧急情况应对冠状大肠杆菌引起的得病因。对于意味著的 COVID-19 大广为人知，之东亚有大约 85% 的 SARS-CoV-2 得病毒得病征遵从了传统观念之首倡流行得病学（9，10）。许多采用的之抑制作用生素是否是兼具理论上的抑制作用冠状大肠杆菌特开放性并在流行得病学上是否是理论上，这个不可忽视解决办法未曾给与更好答复。
之抑制作用生素作为治疗法冠状大肠杆菌所引发得病因的理论上流行得病学，但由于缺乏母体或胃的该系统深入研究，其发展与合理采主要用途外受到了阻挠。为了具体之抑制作用生素的潜在抑制作用 SARS-CoV-2 活命开放性，我们从常以之抑制作用生素之中挑选了多种泡茶合成物，并从之抑制作用生素药物液 RDS(英美两国一种商业开放性食品膳食) 之中挖掘借助于了抑制作用 SARS-CoV 和抑制作用 SARS-CoV-2 大肠杆菌的活命开放性，一种在英美两国的商业食品膳食。RDS 用作减强人母体呼喉该系统的总体有益，其举例来说多种泡茶化学物质，如大蒜和蒲公英，它们是传统观念上用作压制上皮细胞和心脏得病因的之中泡茶 (11-13)。在此，我们报道 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 假大肠杆菌以及兼具得病疗效的野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌对孔洞核的得病毒兼具抑制作用菌。我们全面性证明 RDS 可通过这样一来灭活命大肠杆菌外层或阻止大肠杆菌侵入而抑制作用大肠杆菌的现代得病毒延迟。此外，我们挖掘借助于 RDS 还可以阻止乙流大肠杆菌对孔洞核的得病毒。这些相比之下，RDS 对心脏大肠杆菌的得病毒有可能兼具普遍的抑制作用菌。
▋结果
为了从传统观念之中泡茶之中找到潜在的抑制作用 SARS-CoV-2 活命开放性，我们从约四十种传统观念泡茶之中挑选合成借助于 SARS-CoV-2S 酶假型太快大肠杆菌[14,15] 和人母体心脏 A549(ACE2) 孔洞核，此人类 ACE2 突变会通过太快大肠杆菌转导作为载体介导，从而稳定转导来解决问题超暗示。太快假型大肠杆菌采用红色荧光酶 (GFP) 或荧光素在酶 (Luc) 作为报道突变，并通过了兼具广谱抑制作用大肠杆菌进入药剂，以及萨拉多尔 (Arbidol)[16]，和人类抑制作用毒血清对抑制作用 SARS-CoV-2(左图 1a、C) 的验证。我们并能成功电子束到萨拉多尔 (Arbidol) 和抑制作用毒血清对于 SARS-CoV-2 假型大肠杆菌的抑制作用菌，这是我们在其他四十余种传统观念泡茶合成物试验中之中并未挖掘借助于的，都有其之中一些发挥作用较高疗效的泡茶 (左图 1a-C)。然而，鉴于太快开放性假型大肠杆菌仅仅能电子束 SARS-CoV-2 大肠杆菌的侵入行为，我们没法排除这些泡茶合成物有可能有在进入后阶段并能抑制作用 SARS-CoV-2 的有可能开放性。我们全面性从传统观念药剂生发肺毒药物液 (RDS) 之中挑选借助于了有可能的抑制作用 SARS-CoV-2 活命开放性，该产品所内含九种泡茶化学物质——、苍耳、大蒜、蒲公英、玄参、苦杏仁、蜂房、皂角、绿叶，在之东亚传统观念上用作治疗法心脏得病因 (11-13)。
所内含乙基咖啡豆酸、3，4-二邻咖啡豆苯基奎宁酸、乙基 3，4-二邻咖啡豆苯基奎宁酸、原儿茶酸、乙基绿原酸和荨麻草素在；淡紫色之中还所内含乙酰 A、B 和 10 种已知环乙烯醚萜乙酰[17]；该树种还所内含皂甙甙 A 和 B，以及抑制作用上皮细胞作用的乙酰 C[18,19]。苍耳酯乙酰之中所内含木脂素在、松脂醇和苍耳乙酰[20]。大蒜之中所内含被称作大蒜皂乙酰的甾体皂乙酰，是大蒜属树种独有的树种化学物质[21,22]。细叶蒲公英之中主要活命开放性化学物质为四种单萜，(−)-薄荷酯、(+)-普曼尼酯、(−)-柠檬乙烯和 (+)-薄荷呋喃；这种树种还所内含其他氧化物，如 1-辛乙烯-3-醇、3-辛酯、β-同年桂乙烯和β-黄杨乙烯[23]。玄参所内含大约 162 种氧化物，都有环乙烯醚萜和环乙烯醚萜乙酰、苯丙乙酰、水溶性、萜类、糖类、黄酯类、和皂乙酰[24]。苦杏仁之中所内含酚类、氰基氧化物和果胶多糖[25]。皂角刺之中所内含皂乙酰和羽扇豆酸[26,27]，而绿叶之中所内含主要活命开放性化学物质绿叶酸[28]。为了全面性试验中 RDS 的抑制作用 SARS-CoV-2 活命开放性，用不同酒精溶解度的 RDS 重构 A549(ACE2) 细胞核，然后让这些细胞核在发挥作用 RDS 的有可能会下遵从 4-6 不间断的得病毒。得病毒后，在不发挥作用 RDS 的有可能会下培养借助于来细胞核，然后在 48 和 72 不间断的时候，通过流德式细胞核法术对大肠杆菌得病毒的抑制作用菌开展举例来说。为了压制细胞核疗效，采用乙酸丙啶 (PI) 对即将丧生和已丧生的细胞核开展上色，仅仅在活命细胞核群之中比对 GFP+细胞核。如左图 2 上图，我们掩蔽到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 假大肠杆菌兼具浓度诱发抑制作用菌。为了证实这些结果，我们采用内源开放性暗示 ACE2 的 VeroE6 细胞核多次重复了该得病毒测试。
(见下页左图)
ACE2 在表面上暗示，生产开放性 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 大肠杆菌可对其开展得病毒，ACE2 通常以作冠状大肠杆菌的深入研究 (7)。考虑到在缺乏 ACE2 超暗示 [15，29，30] 的有可能会下，假型大肠杆菌对 VeroE6 的得病疗效较低，我们还采用了荧光素在酶报道突变假型大肠杆菌，该大肠杆菌的报道突变暗示由 HIV-1LTR 和 Tat 特别设计，兼具极低的报道突变敏感开放性和信噪比。
左图 2：RDS 抑制作用 SARS-CoV-2(GFP) 假型大肠杆菌得病毒 A549(ACE2) 细胞核。
A.A549(ACE2) 细胞核用 RDS 近十年酒精 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 假型大肠杆菌得病毒。将细胞核后下去大肠杆菌和 RDS，并在不发挥作用 RDS 的有可能会下开展培养借助于来。流德式细胞核容电子束大肠杆菌得病毒抑制作用有可能会。未得病毒的细胞核和得病毒 SARS-CoV-2(GFP) 但私自 RDS 治疗法的细胞核作为解读。GFP+细胞核比例已表明。(PI) 乙酸丙啶。
B.RDS 的细胞核疗效表征。A549(ACE2) 细胞核用 RDS 近十年酒精 4 不间断，后下去 RDS，无 RDS 培养借助于来 48 不间断。乙酸丙啶上色认定恰巧在丧生细胞核和已丧生细胞核，流德式细胞核法术比对。绘抑制作用生素量-加成细胞核疗效曲率，RDS 的半活命埋溶解度 (LC50) 数目为 1:11.9。
如左图 3A 上图，我们采用 Luc 报告突变假大肠杆菌和 VeroE6 细胞核开展得病毒测试，掩蔽到 RDS 对该大肠杆菌得病毒兼具浓度诱发抑制作用菌，并且半数抑制作用溶解度具体为 1:230RDS 酒精度 (左图 3B)。我们还举例来说了 RDS 对 VeroE6 细胞核活命力的因素在，具体了 50% 细胞核丧生浓度为 1:11.8RDS 酒精度。
左图 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 假大肠杆菌和野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌的浓度诱发抑制作用抑制作用菌。用 RDS 近十年酒精重构 A、BVeroE6 细胞核，会用 SARS-CoV-2(Luc) 假型大肠杆菌得病毒。将细胞核后下去大肠杆菌和 RDS，并在不发挥作用 RDS 的有可能会下开展培养借助于来。在得病毒后 72 不间断用荧光素在酶电子束大肠杆菌得病毒的抑制作用菌。未得病毒细胞核和 SARS-CoV-2-luc 得病毒但私自过 RDS 治疗法的细胞核作为解读。测试多次重复三次。绘抑制作用生素量加成曲率和 RDS 的 I-C50 酒精数目为 1:230。CRDS 对 VeroE6 细胞核的细胞核疗效也通过乙酸丙啶上色和流德式细胞核法术表征。用 RDS 近十年酒精 4 不间断，后下去 RDS，在不内含 RDS 的有可能会下培养借助于来 72 不间断。绘成细胞核疗效浓度-加成曲率，RDS 的半活命埋溶解度 (LC50) 数目为 1:13.8 酒精。DRDS 抑制作用传染开放性 SARS-CoV-2 得病毒。用近十年酒精的 RDS 重构 VeroE6 细胞核，并在 RDS 发挥作用的有可能会下得病毒 SARS-CoV-2。得病毒 48 不间断后，通过异种菌斑比对大肠杆菌释放后的大肠杆菌粘贴抑制作用有可能会。抑制作用试验中一德式三份开展，并在 Prism7(Graph Pad) 之中采用单向以外绝对值 (One-Way ANOVA) 比对及 Dunnett 后检查 (Dunnett's Post Test)，以此具体总和显着开放性。绝对值得注意开放性绝对值用下标指借助于如下：*p
为了全面性验证采用假大肠杆菌获的结果，我们试验中了 RDS 对于 SARS-CoV-2 得病毒的绕过传染开放性并能。如左图 3D 上图，RDS 同时也绕过了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 细胞核的得病毒。RDS 在酒精 1:40 以上时可绝对值得注意缩减大肠杆菌突起的形成。
综上，通过 SARS-CoV-2 假大肠杆菌与传染开放性大肠杆菌的相比之下，RDS 所内含抑制作用 SARS-CoV-2 得病毒的活命开放性化学物质，有可能是通过这样一来灭活命大肠杆菌或绕过大肠杆菌的现代得病毒延迟。
为全面性深入研究有可能的功能，我们将传染开放性 SARS-CoV-2 大肠杆菌外层与近十年酒精的 RDS 在 37°C 下预培养借助于来 1 不间断。随后，将硫酸全面性依次酒精-(10–1 至 10–4)，并自组 Vero 细胞核开展异种菌斑比对以具体大肠杆菌得病疗效的降低。如左图 4A 上图，我们掩蔽到在 RDS 之中短暂暴露一不间断后的大肠杆菌外层，其 SARS-CoV-2 的得病毒效价也呈浓度诱发下降。该结果证实了 RDS 可理论上这样一来灭活命 SARS-CoV-2 大肠杆菌外层的传染开放性。
我们全面性试验中了 RDS 是否是也能抑制作用 SARS-CoV-2 大肠杆菌种属的得病毒。为此，我们依靠最近开发的分离乙大肠杆菌-SARS-CoV-2 假型大肠杆菌 (Ha-CoV-2)[31] 来分离出一新作 S 酶专有名词，都有英国专有名词 (B.1.1.7)，南非专有名词 (B.1.351)，巴西专有名词 (P.1)，加州专有名词 (B.1.429)，和其他几个新兴专有名词 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和就其 S 酶个体差异体在 37°C 近十年酒精 RDS 培养借助于来 1 不间断。随后，用该硫酸得病毒 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 孔洞核。得病毒后 12 不间断，荧光素在酶检测大肠杆菌得病毒的抑制作用菌。如左图 4B 上图，我们还掩蔽到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 酶专有名词的浓度诱发抑制作用。
我们还试验中了 RDS 绕过 SARS-CoV 得病毒的并能，采用带有 SARS-CoV 突刺酶的 GFP 报道突变太快大肠杆菌和[15] 伪浓度。我们将人 A549(ACE2) 细胞核用作孔洞核，将其用新作酒精的 RDS 重构，然后用 SARS-CoV(GFP) 报告突变假大肠杆菌得病毒 4-6 不间断。得病毒后在不内含 RDS 的有可能会下培养借助于来细胞核，流德式细胞核法术举例来说电子束其对大肠杆菌得病毒的抑制作用菌。或多或少，采用乙酸丙啶排除恰巧在丧生与已丧生的细胞核，仅仅在活命细胞核群之中比对 GFP+细胞核。如左图 5A 上图，我们掩蔽到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 假型大肠杆菌的抑制作用菌呈浓度诱发。我们全面性证实了这些结果，并举例来说了 RDS 介导的抑制作用与 Luc 报道突变 SARS-CoV 假型大肠杆菌，SARSCoV(Luc)。我们掩蔽到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的抑制作用菌呈浓度开放性依赖，其半抑制作用溶解度 (IC50) 为 1:70.88 酒精度 (左图 5B，C)。考虑到 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都采用 ACE2 得病毒孔洞核，我们还试验中了 RDS 的抑制作用大肠杆菌活命开放性是否是仅仅针对与 ACE2 有相互作用的冠状大肠杆菌。为此，我们电子束了一种不就其的负链 RNA 大肠杆菌--亚型霍乱大肠杆菌。它通过大肠杆菌血凝素在 (HA) 和细胞核α-唾液酸来得病毒孔洞核。为了分离出亚型霍乱大肠杆菌，将暗示亚型霍乱 A/WSN/33(H1N1) 突变组每个片段的 8 个载体和一个 GFP-报道突变共转染到 HEK293T 细胞核之中。在 RDS 发挥作用的有可能会下，得来大肠杆菌外层会用作得病毒目标 MDCK 细胞核。如左图 6A 上图，我们掩蔽到 RDS 对亚型霍乱大肠杆菌的抑制作用菌呈浓度诱发。RDS 在 1:40 和 1:80 酒精时可完全绕过大肠杆菌得病毒，在 1:160 酒精时则可部分抑制作用亚型霍乱。RDS 对 MDCK 细胞核的半活命埋溶解度 (LC50) 经检测为 1:18.5(左图 6B)。这些相比之下，RDS 的抑制作用大肠杆菌活命开放性并非针对特定大肠杆菌，而有可能并能普遍抑制作用多种心脏大肠杆菌，如冠状大肠杆菌和亚型霍乱大肠杆菌。
▋辩论
在本报告之中，我们显然传统观念药剂生发肺毒药物液 (RDS) 所内含广谱抑制作用大肠杆菌活命开放性，可绕过 SARS-CoV、SARSCoV-2 和亚型霍乱大肠杆菌的得病毒。虽然 RDS 并能抑制作用多种大肠杆菌，但其抑制作用大肠杆菌活命开放性因大肠杆菌型德式和毒株而异。例如，对 SARS-CoV 太快假大肠杆菌的 I-C50 溶解度为 1:7.9 酒精度，对 SARS-CoV-2 太快假大肠杆菌的 I-C50 溶解度为 1:230 酒精度。对于传染开放性野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌，I-C50 为 1:40 酒精度，对亚型霍乱，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其种属有不同的抑制作用菌，IC50 数绝对值从 1:70 到 1:2601 酒精度不等 (左图 4B)。
(见下一页左图)
左图 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和共通的 Ha-CoV-2 种属兼具浓度诱发灭活命作用。ASARS-CoV-2 外层加近十年酒精的 RDS 在 37°C 下培养借助于来 1 不间断。随后，将硫酸全面性近十年酒精，并自组 Vero 细胞核之中开展异种菌斑比对，以具体大肠杆菌得病疗效降低。抑制作用试验中一德式三份开展，并在 Prism7(GraphPad) 之中采用单向以外绝对值 (One-WayANOVA) 比对和 Dunnett 后检查 (Dunnett'sPostTest) 以此具体总和显着开放性。绝对值得注意开放性绝对值用下标指借助于如下：*p
BHa-CoV-2(Luc) 和就其 S 酶专有名词与近十年酒精的 RDS 在 37°C 培养借助于来 1 不间断后，用硫酸得病毒 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 孔洞核。得病毒后 12 不间断，荧光素在酶检测大肠杆菌得病毒的抑制作用菌。RDS 的 IC50 绝对值的酒精度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。
我们全面性显然 RDS 可以抑制作用冠状大肠杆菌的现代得病毒延迟。虽然具体的抑制作用大肠杆菌功能未曾清楚，但 RDS 可以通过这样一来灭活命大肠杆菌外层或通过阻止大肠杆菌侵入或绕过大肠杆菌侵入后的现代延迟来阻止大肠杆菌得病毒。在其他几种传统观念之抑制作用生素之中也挖掘借助于了抑制作用 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的活命开放性。例如，一种常用的传统观念之抑制作用生素——绿叶。
绿叶根之中已证明所内含绿叶酸素在，可抑制作用 SARS 大肠杆菌[32] 流行得病学分离借助于来株的粘贴。此外，另一种可用作治疗法心脏得病因的之抑制作用生素——双黄连抑制作用生素，已表明借助于在胃以浓度诱发手段抑制作用 SARS-CoV-23CL 酶酶 (3CLpro) 活命开放性。悬钩子乙酰和悬钩子素在拟作为双黄连绕过 3CLpro[33] 的理论上化学物质。
左图 5 RDS 抑制作用 SARS-CoV 假型大肠杆菌对 A549(ACE2) 细胞核的得病毒。用近十年酒精的 RDS 重构 A、B 细胞核，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 假型大肠杆菌得病毒。将细胞核清后下，去除大肠杆菌和 RDS，在不发挥作用 RDS 的有可能会下开展培养借助于来。在得病毒后 48 不间断和 72 不间断，通过流德式细胞核法术或荧光素在酶电子束来表征大肠杆菌得病毒的抑制作用菌。测试多次重复三次。绘抑制作用生素量积极响应曲率，并绘成 RDS 的 IC50 绝对值为 1:70.9 酒精度 (C)
左图 6 RDS 抑制作用乙流大肠杆菌对 MDCK 细胞核的得病毒。(A) 用近十年酒精的 RDS 重构 MDCK 细胞核 30 分钟，然后用乙流大肠杆菌 (GFP) 对其开展得病毒。得病毒后，在 RDS 发挥作用下培养借助于来细胞核。36 不间断后用流德式细胞核容对大肠杆菌得病毒的抑制作用菌开展表征。把未得病毒的细胞核与被乙流大肠杆菌 (GFP) 得病毒但私自 RDS 处理过程的细胞核开展对比。左图之中表明了 GFP+细胞核的比例。PI 指借助于乙酸丙啶 PI。
(B) 另外还采用了 MTT 检测法表征了 RDS 对 MDCK 细胞核的疗效，绘成了细胞核疗效的浓度-加成曲率，经计算，RDS 的半数活命埋溶解度为 1:18.5 酒精度 RDS 的理论上抑制作用大肠杆菌化学物质未曾具体。然而，RDS 不同于悬钩子乙酰和悬钩子素在，RDS 可以通过这样一来灭活命大肠杆菌光子来绕过大肠杆菌得病毒 (左图 4)，而悬钩子乙酰和悬钩子素在则在大肠杆菌生命周期的后期通过绕过大肠杆菌酶酶的活命开放性来发挥作用。然而，RDS 的胃抑制作用 SARS-CoV-2 活命开放性仍需在今后的爬虫类深入研究和人类流行得病学试验中之中给与证实。目前为止，我们恰巧在开展小型爬虫类测试，以具体 RDS 在母体绕过 SARS-CoV-2 大肠杆菌得病毒的创造力。
▋论断
我们的深入研究证明，RDS 可普遍抑制作用心脏大肠杆菌的得病毒，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和亚型霍乱。
▋方法有
细胞核和细胞核培养借助于来
HEK293T (ATCC 伊萨吉尔，缅因州) MDCK (ATCC 伊萨吉尔，缅因州)，VeroE6 (ATCC 伊萨吉尔，缅因州) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 赐与，伊萨吉尔，缅因州)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 赐与，伊萨吉尔，缅因州) 目前为止保存于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔生物科技 Thermo Fisher Scientific) 所内含 10% 热灭活命 FBS 和 1×氯霉素在-深入研究成果 (赛默飞世尔生物科技 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞核培养借助于来基之中分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的溶解度自组嘌呤霉素在和潮霉素在 B。
质粒转染和大肠杆菌分离出
内含 SARS-CoVS 酶或 SARS-CoV-2S 酶的太快开放性假型大肠杆菌外层由 Virongy LLC (Manassas，VA) 给予，或按照下面揭示的方法有[15] 分离出。简言之，为了分离出 GFP 报道突变太快开放性假大肠杆菌，HEK293T 细胞核与暗示 SARS-CoVS 酶或 SARS-CoV-2S 酶的载体、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 共转染。为了减量荧光素在酶报道突变太快开放性假型大肠杆菌，将 HEK293T 细胞核与暗示 SARSCoVS 酶或 SARS-CoV-2S 酶的载体、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 开展共转染。转染后 48 不间断得来大肠杆菌上清液，离心精制，−80℃ 保存。野生型 SARS-CoV-2 大肠杆菌 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 给予。pHW-NAGFP (ΔAT6) 报告突变质粒和 A/WSN/1933 H1N1 共通质粒 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi 博士友好给予。在霍乱大肠杆菌 A-GFP 报道突变光子分离出之中，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 共转染 HEK293T 细胞核 (ΔAT6)。48 不间断后得来大肠杆菌上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 暗示载体购自 Sinobiological。依靠 Twist Bioscience 合成了 Ha-CoV-2(Luc) 载体和 S 酶个体差异载体。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 酶个体差异光子按照下面揭示方法有[31] 开展分离出。
大肠杆菌得病毒和药剂抑制作用试验中
RDS(生发肺毒药物液)(来自 Dejia Harmony 赐与，利斯堡，缅因州) 是由马博士Laboratory (Burnaby，BC，Canada) 生产的一种商业产品。RDS 之中所有之中泡茶化学物质以外合理《之东亚成药 2015 年版》「饮片」常规，都有理论上化学物质内含量及重金属、农药附赠电子束。RDS 是一种之抑制作用生素的共煎剂，事与愿违产物在真空有条件下溶化。SARS-CoV-2 抑制作用血清由 LanceA. Liotta 护士给予。将萨拉朵尔盐酸盐 (Sigma) 重新悬浮在二乙基亚砜 (Sigma) 之中。对于假型大肠杆菌得病毒，12 孔板之中的 A549(ACE2) 细胞核 (来自 Virongy LLC 赐与，伊萨吉尔，缅因州) 或 VeroE6 细胞核用 RDS 重构 30 分钟，在 37℃ 下得病毒 4-6 不间断，然后在新鲜培养借助于来基之中温水培养借助于来 48-72 不间断。对于 VeroE6 细胞核的得病毒，细胞核也被 CoV-2 假型大肠杆菌得病毒减强剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 赐与，伊萨吉尔，缅因州) 重构后，在 37°C 下于是又处理过程 30 分钟。采用 GloMaxDiscover 酶标容 (Promega) 比对细胞核裂解物的荧光素在酶活命开放性。对于野生型 SARS-CoV-2 得病毒，VeroE6 细胞核在 37°C 下用 RDS 重构 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 得病毒 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在查尔斯梅森私立大学的 BSL-3 救助设施内返程 1 不间断。细胞核用 PBS 温水 2 次，用内含 RDS 的培养借助于来基培养借助于来 48 不间断。从上清之中合成大肠杆菌，用 12 孔板培养借助于来的 Vero 细胞核单层之中的异种菌斑试验中检测小瓶滴度。简言之，每个电子束在完整的 Dul-becco's ModifiedEagle 培养借助于来基 (VWR) 之中分离出，举例来说 1X 氯霉素在-深入研究成果 (VWR)，并添加 10% 的 FBS(赛默飞世尔生物科技 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种酒精液喉附到 VeroE6 细胞核单层的三个平行孔上 1 不间断。然后用 1～2 ml0.6% 里塔糖 (Invitrogen) 和一部分完整的 Eagle Minimal Essential 培养借助于来基 (VWR) 的硫酸隔开单层，内含 1X 氯霉素在-深入研究成果，并添加 10%FBS。48 不间断后，将单层上皮细胞固定在 10% 乙醛溶液之中 1 不间断，并添加隔开的里塔塞。为了上色突起，自组所内含 20% 乙醇的 1% 结晶紫染料溶液 5 分钟，然后用去离子水温水。对于亚型霍乱大肠杆菌得病毒 MDCK 细胞核，在 37°C 下用 RDS 重构 30 分钟，然后用 A-GFP 报道突变大肠杆菌得病毒 6 不间断。用内含 RDS 的培养借助于来基温水细胞核，培养借助于来 36 不间断。GFP 暗示通过流德式细胞核容表征。(FACSCalibur，BD Biosciences).
对于 SARS-CoV-2 大肠杆菌外层的 RDS 灭活命试验中，将 100μl 近十年酒精的 RDS 添加到 1 mlSARS-CoV-2 大肠杆菌原液 (3.65×105PFU/ml) 之中，事与愿违 RDS 酒精为 1:20，1:40 或 1:80。也都有解读有条件 (1 ml 大肠杆菌+100μl 培养借助于来基)。硫酸在 37°C 下培养借助于来 1 不间断。随后，对硫酸开展新作酒精以诱发额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 酒精度，并将近十年酒精的电子束自组 12 孔板之中的 Vero 细胞核之中，用作开展异种菌斑检测比对。突起检测之中事与愿违的 RDS 酒精度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 酒精液。
Ha-CoV-2(Luc) 和 S 酶个体差异光子按照下面揭示的方法有[31] 分离出。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭活命，将 5μl 近十年酒精的 RDS 添加到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或专有名词之中，事与愿违 RDS 酒精度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将硫酸在 37°C 下培养借助于来 1 不间断，然后在 RDS 发挥作用下得病毒 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞核 12 不间断。采用 GloMax Discover 酶标容 (Promega) 比对细胞核裂解物的荧光素在酶活命开放性。
细胞核疗效比对电子束
用乙酸丙啶上色和流德式细胞核法术举例来说对 A549 (ACE2) 细胞核和 VeroE6 细胞核的药剂细胞核疗效开展电子束，如概述 (34)。采用细胞核减殖还原剂盒 I(MTT) (Sigma) 和大厂建议的方案对 MDCK 细胞核的药剂疗效开展举例来说。简言之，将 MDCK 细胞核 (ATCC) 以每孔 1×-105 个细胞核的速度接种到 12 孔板之中。细胞核培养借助于来隔夜后，通过 RDS 处理过程 1 天，然后在 MTT 标示借助于还原剂 (Sigma) 的培养借助于来基之中培养借助于来。将细胞核与标示借助于还原剂共同完成培养借助于来 4 不间断，于是又后续自组 MTT 减溶液。培养借助于来皿孵育过夜，用 GloMax Discover 酶标容 (Promega) 检测喉光度。
简称
SARS-CoV：严重急开放性呼喉该系统综合症就其冠状大肠杆菌；SARSCoV-2：Severe 严重急开放性呼喉该系统综合症就其冠状大肠杆菌-2；TCM：传统观念之抑制作用生素；RDS：心脏排毒药物液；Ha-CoV-2：分离亚型新冠大肠杆菌假大肠杆菌。
致谢
深受感动 FengLi 给予霍乱大肠杆菌暗示载体，深受感动 LanceLiotta 给予抑制作用毒血清；深受感动 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的辩论与建议；深受感动 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 给予 RDS 和泡茶合成物。
作者重大贡献
此次测试由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 新设计，由 Y.W. 撰稿，由 L.A.H. 编辑。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 执行了该测试。所有作者已读到并批准后事与愿违文稿。
资金
本深入研究的经费来自于查尔斯梅森私立大学在表面上拨款 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该款项由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 给予。
数据和材料的可用开放性
本深入研究之中诱发或比对的所有数据以外举例来说在本文之中。还原剂可从 Y.W 处获取。
发表声明
批准后及参加指借助于同意
不适用
指借助于同意借助于版
不适用
竞争利益
查尔斯梅森私立大学发展中国家生物部署和狂犬得病之中心的 RMH 和 YW 已获了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的深入研究资助，LAH 为德佳和畅转任负责人并获了酬金。并未其他关系或活命动有可能会因素在到提交的工作。
作者详细信息
1英美两国缅因州查尔斯梅森私立大学该系统生物学的学院发展中国家生物部署和狂犬得病之中心，伊萨吉尔 20110。
2VirongyLLC，缅因州伊萨吉尔。3加拿大伯纳比，BCV5J0E5 马博士Laboratory (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 英美两国缅因州利斯堡世界卫生社会科学组织，20176。
收稿应于：2021 年 4 同年 7 日
遵从应于：2021 年 5 同年 10 日
线上借助于版时间：2021 年 5 同年 29 日
注解
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编辑： 翟超男相关新闻
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